SEASENSING
SOBRE EL PROYECTO
El objetivo general del proyecto es desarrollar plataformas genéricas para la detección molecular, la identificación cualitativa y la cuantificación de distintas especies de microalgas tóxicas presentes en ecosistemas marinos. Estos dispositivos facilitarán una gestión óptima
de las pesquerías y la acuicultura, la protección de la salud, y un mejor conocimiento de los ecosistemas marinos.
El proyecto se basará en la estrecha colaboración establecida entre los grupos de la URV y el IRTA y se construirá combinando la experiencia y conocimiento de ambos grupos en cada una de las etapas del proyecto.
La tecnología central se basa en un proceso de dos fases para la identificación de especies seguida por la medida cuantitativa de determinadas secuencias de DNA diana. La primera fase explotará un microsistema serigrafiado capaz de realizar amplificación isotérmica de ácidos nucleicos, con el objetivo de que tenga un coste de 3 €, que el ensayo dure menos de 1 hora y que pueda realizar una detección múltiple de hasta 10 dianas, proporcionando una herramienta de cribado in situ, rápida, económica y de fácil uso. Posteriormente a la identificación, se desarrollará una matriz de electrodos nanoestructurados con diatomeas y con primers funcionalizados para la amplificación a tiempo real en fase sólida con detección electroquímica cuantitativa.
Este dispositivo tendrá un coste de 30-100 € y realizará la detección in situ de hasta 100 dianas a la vez también en menos de 1 hora. Se microfabricará un módulo de pre-tratamiento de muestra económico y de un solo uso, que generará DNA de doble hélice de alta calidad.
Karlodinium es un género de dinoflagelados conocido por la ictiotoxicidad de algunas de sus especies, las cuales producen mortalidades de peces pero también de moluscos y fauna
marina.
El género Ostreopsis ha estado implicado en problemas de alergia en humanos expuestos a aerosoles marinos ya sea a través del contacto o la inhalación, lo cual ha generado problemas para los bañistas en el Mediterráneo, incluyendo distintos puntos de la costa española. Además, Ostreopsis produce potentes neurotoxinas implicadas en mortalidades de fauna marina. Las ciguatoxinas son toxinas producidas por microalgas del género Gambierdiscus que producen intoxicaciones debido al consumo de pescado. Incluso en nuestras latitudes, en zonas como Macaronesia, Islas Canarias, Creta y Madeira, se han registrado intoxicaciones.
Se estima entre 50.000-500.000 las personas afectadas cada año por este tipo de intoxicación, e incluso algunos casos de muerte. Se utilizarán estas tres microalgas modelo para demostrar las tecnologías a desarrollar, los géneros representando diferentes niveles de dificultad de detección en términos de células/mL y número de especies cuya detección se requiere (Karlodinium: 3 especies, 1000 células/mL; Ostreopsis: 3 especies, 10 células/mL; Gambierdiscus: 10-12 especies, 1-10 células/mL).
Aunque los métodos de microscopía para identificación y cuantificación de microalgas se siguen utilizando, son tediosos y requieren muchas horas de personal especializado. Los microsistemas desarrollados permitirán identificar precisa e inequívocamente, y realizar múltiples análisis in situ y a tiempo real de manera económica y rápida. Estas herramientas de cribado serán de gran utilidad para detectar la posible presencia de situaciones de riesgo
y para reaccionar a tiempo y de manera eficaz, así como para mejorar el conocimiento de los ecosistemas marinos.
Microsistemas para la detección
rápida, fiable y rentable de microalgas tóxicas in situ y a tiempo real
Successful incorporation of sample pre-treatment module onto screen printed microsystem and electrode array quantitative detection so that a less than 10 minute
operation permits NAA, labelling and detection without interferences.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS - IRTA
01
Successful multiplexing from dried RPA reagents for at least 3 sequences of chosen toxic algae genera for on line use in screen printed microsystem enabled by flow control of capillary flow through electrochemically activated valves in less than 30 minutes.
02
03
Labelling and electrochemical detection without a wash step enabling operation of screen printed microsystem and achieving detection in less than 5 minutes and a total assay
time of less than 45 minutes (ideally 20). The detection should ideally guarantee in this time Scale less than 10 CFUs/mL in the starting sample.
Establishment of product design requirements regarding ease of use and cost. The
document should take into account at least the EPOs of the project.
Development of thermal cycling and RPA protocols for NAA, including, in the cases that are not available, primer design and securing no interference with multiplexing of at least three target amplification.
06
07
Electrode nanostructuring and characterisation establishing clear figures of merit to be
used both in screen printed microsystem (where sensitivity and selectivity of electrodes is sought) and in the quantitative array for solid phase RPA (where signal enhancement is
sought).
08
04
Electrode array design and realisation so that modification with primers for RPA amplification can be achieved and detection realised without interference from neighbouring
sites.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS - URV
05
Labelling and electrochemical detection, preferably without a wash or denaturation step enabling quantitative electrochemical detection in less than 30 minutes and a total assay time for quantitation of less than 45 minutes (ideally 20). The detection should ideally 10 de 25 / parte C guarantee in this time scale less a detection limit of 10 CFUs/mL in the starting sample.
09
Establishment of validation protocols and assurance of enough samples to carry out validation of resulting devices. Establishment of figures of merit of both devices (qualitative and quantitative) based on this validation.
